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微生物发酵碳源和氮源

作者:竞博官网 发布日期:2020-10-22 10:12



  1. 应用最广的是谷物淀粉(玉米、马铃薯、木薯淀粉),淀粉水解后得葡萄糖。 使用条件:微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类。

  糖蜜使用的注意点:除糖份外,含有较多的杂质,对发酵产生不利的影响,需要进行预处理。

  来源:一些廉价的原料,如玉米浆、豆饼粉、花生饼粉、鱼粉、酵母浸出膏等。其中玉米浆(玉米提取淀粉后的副产品)和豆饼粉既能做氮源又能做碳源。

  微生物早期容易利用无机氮,中期菌体的代谢酶系已形成——有机氮源。有机氮源来源不稳定,成份复杂,所以利用有机氮源时要考虑到原料波动对发酵的影响。

  硫酸盐、磷酸盐、氯化物及一些微量元素。无机盐含量对菌体生长和产物的生成影响很大。

  生长因子不是所有微生物都必需的。只是对于某些自己不能合成这些成分的微生物才是必不

  可少的营养物。如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型(biotin auxotroph),以生物素为生长因子。

  生物素浓度对菌体生长和谷氨酸积累均有影响。大量合成谷氨酸所需要的生物素浓度比菌体生长的需要量低,即为菌体生长需要的“亚适量”。原因:P263,P260(OD值)

  生物素存在于动植物组织中,多与蛋白质呈结合状态存在。用酸水解可以分开。那么,生产上有哪些原料可以作为生物素来源呢?

  最具代表性。虽然主要用作氮源,但含有乳酸,少量还原糖和多糖,含有丰富的氨基酸,核酸,维生素,无机盐等。常作为提供生长因子的物质。所以,从某种意义上说,玉米浆液用于配制发酵培养基是发酵工业中的一个重大发现。

  (3)糖蜜:两种糖蜜(cane molasses,beet molasses)均可代替玉米浆。但氨基酸等有机氮含量较低。

  在工业生产中,将淀粉水解为葡萄糖(glucose)的过程称淀粉的糖化,制得的溶液叫淀粉水解糖。其主要糖分是葡萄糖。根据水解条件不同,尚有数量不等的少量麦芽糖及其它一些二糖,低聚糖等复合糖。

  2.有些微生物能够直接利用淀粉作原料,但必须在微生物产生淀粉酶后才能进行,过程缓慢,发酵周期延长。

  3.若直接利用淀粉作原料,灭菌过程的高温会导致淀粉结块,发酵液粘度剧增。

  H+对作用点无选择性,A-1,4-糖苷键和A -1,6-糖苷键均被切断。

  在水解过程中,由于受到酸和热的作用,一部分葡萄糖会发生复合反应和分解反应。 淀粉

  复合反应:葡萄糖分子间经1,6糖苷键结合成龙胆二糖(有苦味),异麦芽糖和其它低聚糖(复合低聚糖)。生成的多数复合糖不能被微生物利用,使发酵结束时残糖高。

  分解反应:生成的5„-羟甲基糠醛是产生色素的根源,增加了糖化液精制脱色的困难。 如何控制分解反应和复合反应的发生?

  α-淀粉酶水解底物内部的α-1,4糖苷键,不能水解α-1,6糖苷键,一般采用耐高温淀粉酶,使液化速度加快。85-90℃。

  淀粉的糊化与老化:由于淀粉颗粒的结晶性结构对酶作用的抵抗力非常强,需要先加热淀粉乳,使淀粉颗粒吸水膨胀,糊化,破坏结晶性结构。

  糊化:淀粉受热后,淀粉颗粒膨胀,晶体结构消失,互相接触变成糊状液体,即使停止搅拌,淀粉也不会再沉淀的现象。

  老化:指分子间氢键已断裂的糊化淀粉又重新排列形成新的氢键的过程,也就是复结晶的过程。

  ▲淀粉酶很难进入老化淀粉的结晶区起作用,必须采取相应的措施控制糊化淀粉的老化。 液化程度的控制(液化后需糖化的原因):如果让液化持续下去,虽然最终产物也是葡萄糖和麦芽糖,但:

  b.液化在较高温度下进行,液化时间加长,一部分已液化的淀粉又会重新结合成硬束状态,老化,使糖化酶难以作用。

  c.液化的目的是为了给糖化酶的作用创造条件,而糖化酶水解糊精及低聚糖等分子时,需先与底物分子生成络合结构,然后发生水解作用,这就要求被作用的底物分子有一定的大小范围才有利于糖化酶生成这种结构,底物分子过大或过小都会妨碍酶的结合和水解速度。 根据生产经验,DE值在20-30之间为好,液化终点可通过碘液判断,此时呈棕色。P25 液化到终点后,为了避免液化酶对糖化酶的影响,需对液化液进行灭酶处理,升温到100℃,保持10分钟,降温,供糖化用。

  终点确定:DE值达最高时(DE值不再上升时),停止酶反应(加热至80℃,20min灭酶)。否则 DE值将由于葡萄糖经α-1,6糖苷键起复合反应而降低。糖化的温度(50-60℃)和pH值(4.0-5.0)决定于所用糖化剂的性质。

  -淀粉酶液化,短时间液化,反应往往不彻底。适用:淀粉颗粒坚硬(如玉米、小麦)的原料,若用

  适用:颗粒大小不一(如碎米淀粉)的淀粉原料,若用酸法,则水解不均匀。或者小的水解,大的未水解;或者大的水解,时间长,小的则发生复合反应。

  糖蜜是很好的发酵原料,用其生产,可降低成本,节约能源,便于实现高糖发酵工艺,但有些成分不适合发酵,必须进行预处理。

  2.组成:粘稠、黑褐色、半流动状液体。组成各不相同。除含有发酵性糖分外,还含有胶体物质,灰分,维生素,氨基酸。甘蔗糖蜜中生物素含量较甜菜糖蜜中高。(国外大多以糖蜜为原料生产谷氨酸。

  (2)拮抗生物素:加表面活性剂(Tween 60),阻止油酸合成→磷脂合成不足。

  (3)加青霉素:使新增殖的子细胞不具有完整的细胞壁,改善了细胞膜的渗透性。 另外,从菌种方面:使用油酸或甘油缺陷型,不受培养基中高生物素的影响。

  生长因子(growthfactor)是一类对微生物正常代谢必不可少且不能用简单的碳源或氮源自行合成的有机物。它的需要量一般很少。广义的生长因子除了维生素外,还包括碱基、卟啉及其衍生物、甾醇、胺类、C4~C6的分枝或直链脂肪酸,以及需要量较大的氨基酸;而狭义的生长因子一般仅指维生素。

  生长因子虽是一种重要的营养要素,但它与碳源、氮源和能源不同,并非任何一种微生物都须从外界吸收的。各种微生物与生长因子的关系可分以下几类:

  (1)生长因子自养型微生物(auxoautotrophs) 多数真菌、放线菌和不少细菌,如E.coli(大肠杆菌)等都是不需要外界提供生长因子的生长因子自养型微生物。

  (2)生长因子异养型微生物(auxoheterotrophs) 它们需要多种生长因子,如乳酸细菌、各种动物致病菌、原生动物和支原体等。例如,一般的乳酸菌都需要多种维生素;许多微生物及其营养缺陷型(突变株)都需要不同的嘌呤、嘧啶碱基;Haemophilusinfluenzae(流感嗜血杆菌)需要卟啉及其衍生物作为其生长因子;支原体常需要甾醇;Haemophilusparahaemolyti-cus(副溶血嗜血菌)需要胺类;一些瘤胃微生物需要C4~C6分枝或直链脂肪酸;某些厌氧菌如Bacteroidesmelaninogenicus(产黑素拟杆菌)需要维生素K和氯高铁血红素,等等。

  (3)生长因子过量合成微生物 有些微生物在其代谢活动中,会分泌出大量的维生素等生长因子,因此,它们可以作为维生素等的生产菌。最突出的例子是生产维生素B2的Eremothe-ciumashbya(阿舒假囊酵母,其B2产量可达2.5g/L发酵液)和Ashbyagossypii(棉阿舒囊霉);生产维生素B12的Propionibacteriumshermanii(谢氏丙酸杆菌)、一些链霉菌(如Streptomycesolivaceus[橄榄色链霉菌,3.3mg/L],S.griseus[灰色链霉菌,0.3mg/L])和产甲烷菌等。

  在配制微生物培养基时,如果配制的是天然培养基,则可加入富含生长因子的原料——酵母膏(yeastextract)、玉米浆(cornsteepliquor)、肝浸液(liverinfusion)、麦芽汁(maltextract)或其他新鲜的动植物组织浸液(表5-6,5-7);如果配制的是组合培养基,则可加入复合维生素溶液。

  黄原胶(Xamthan Gum)别名汉生胶,又称黄单胞多糖,是国际上70年代发展起来的新型发酵产品。它是由甘兰黑腐病黄单胞细菌(Xanthomonas campestris)以碳水化合物为主要原料,经通风发酵、分离提纯后得到的一种微生物高分子酸性胞外杂多糖。其作为新型优良的天然食品添加剂用途越来越广泛。 国际上,黄原胶开发及应用最早的是美国。美国农业部北方地区Peoria实验室于60年代初首先用微生物发酵法获得黄原胶。1964年,美国Merck公司Keco分部在世界上首先实现了黄原胶的工业化生产。1979年世界黄原胶总产量为2000t,1990年达4000t以上。在美国,黄原胶年产值约为5亿美元,仅次于抗生素和溶剂的年产值,在发酵产品中居第3位。

  我国对黄原胶的研究起步较晚,进行开发研究的单位,如南开大学、中科院微生物研究所、山东食品发酵研究所等,均已通过中试鉴定。目前全国有烟台、金湖、五连等数家黄原胶生产厂,年产在200t左右,主要用作食品添加剂。我国生产黄原胶的淀粉用量一般在5%左右,发酵周期为72~96h,产胶能力

  30~40g/L,与国外比较,生产水平较低。随着黄原胶生产和应用范围的进一步发展,目前北京、四川、郑州、苏州、山东等地都有黄原胶生产新厂建成,预示着我国的黄原胶生产将呈现一个新的局面。

  黄原胶是以5分子糖为一单元,由与此相同的单元聚合而成的高分子多糖物质。每一单元由2分子葡萄糖,2分子甘露糖和1分子葡萄糖醛酸组成。其主链由β-葡萄糖通过1,4-糖苷键相连而成的2分子葡萄糖为单元,其结构与纤维素结构相同,相间在葡萄糖的C3上连有2分子甘露糖和1分子葡萄糖醛酸构成侧链。在侧链上有丙酮酸及竣酸侧基。因其侧链含酸性基团,在水溶液中呈多聚阴离子,构成黄原胶的三级立体结构:带阴离子的侧链缠绕主链形成螺旋结构,分子间靠氢键形成双股螺旋,而双股螺旋结构间又是靠微弱的非共价键维系,形成规则的超级接合带状的螺旋聚合体”。

  随着剪切速率增加,因胶状网络遭到破坏,导致粘度降低,胶液变稀,但一旦剪切力消失,粘度又可恢复,因而使黄原胶具有良好的泵送和加工性能。利用这种特性在需要添加增稠剂的液体中加入黄原胶,不仅液体在输送过程中容易流动,而且静止后又能恢复到所需要的粘度,因此被广泛应用于饮料行业。 ② 低浓度时的高粘性

  含2%~3%黄原胶的液体,其粘度高达3~7Pa.s。黄原胶的高粘性使其具有广阔的应用前景,但同时又给生产上的后处理带来麻烦。

  黄原胶在相当宽的温度范围内(-98~90℃)粘度几乎无变化。黄原胶即使在130℃的高温下保持36min后冷却,溶液的粘度也无明显变化。在经多次冷冻-融化循环后,胶液的粘度并不发生改变。在高温条件下若添加少量电解质如0。5%NaCI,可稳定胶液的粘度。

  黄原胶水溶液的粘度几乎与pH值无关。这一独特性质是其他增稠剂如竣甲基纤维素(CMC)等所不具备的。

  黄原胶可与绝大部分的常用食品增稠剂溶液溶混,特别是与藻酸盐类、淀粉、卡拉胶、瓜胶溶混后,溶液的粘度以叠加的形式增加。

  黄原胶易溶于水,不溶于醇、酮等极性溶剂。在非常广的温度、pH和盐浓度范围内,黄原胶很容易溶解于水中,其水溶液可在室温下配制,搅动时应尽可能减少空气混人。如果将黄原胶预先与一些干物质如盐、糖、味精等混匀,然后用少量水湿润,最后加水搅拌,这样配制出的胶液其性能更好。 ⑥ 分散性及保水性

  黄原胶是食品添加剂中优良的悬浮剂和乳化稳定剂。黄原胶对食品具有良好的保水、保鲜作用。

  黄原胶生产有广泛的微生物来源,黄单胞菌属的许多种类菌株都能产生黄原胶。目前,国内外用于生产黄原胶的菌种大多是从甘兰黑腐病病株上分离到的甘兰黑腐病黄单胞菌,也称野油菜黄单胞菌。另外生产黄原胶的菌种还有菜豆黄单胞菌(X. phaseoli)、锦葵黄单胞菌(X. Malvacearum)和胡萝卜黄单胞菌(X. carotae)等。我国目前已开发出的菌株有南开-01、山大-152、008、L4和L5。这些菌株一般呈杆状,革兰氏染色阴性,产荚膜。在琼脂培养基平板上可形成黄色粘稠菌落,液体培养可形成粘稠的胶状物。

  黄原胶发酵培养基的碳源一般是糖类、淀粉等碳水化合物。在黄单胞菌菌体内酶的作用下,1、6-糖苷键被打开,形成直链多糖,经进一步转化,最终变成产物黄原胶。氮源一般以鱼粉和豆饼粉为主。另外,还添加一些微量无机盐,如铁、锰、锌等的盐类。特别是轻质碳酸钙以及NaH2PO4和MgSO4,它们对黄原胶的合成有明显的促进作用。

  例如南开大学的南开-01菌种所使用的摇瓶发酵培养基如下:玉米淀粉4%,鱼粉蛋白胨0.5%,轻质碳酸钙0.3%,自来水配制,pH7.0。在大罐生产中将鱼粉蛋白胨改成鱼粉直接配料,其他原料不变。国外用作黄原胶发酵的碳源多数是葡萄糖。

  摇瓶发酵条件:接种量1%~5%,旋转式摇床转速220r/min,培养温度28℃,发酵72h左右。发酵结束,黄原胶产酸能力为20~30g/L,对碳源的转化率在60%~70%。

  接种量为5%~8%。由于培养基的高粘度,黄原胶生产属高需氧量发酵,需大通风量,一般为1~0.6m3/(m3min)。发酵温度为25~28℃。碳源的起始浓度一般在2%~5%。

  黄原胶的收率取决于碳、氮源的种类和发酵条件。目前收率一般在起始糖量的40%~75%。黄单胞菌容易利用有机氮源,而不易利用无机氮源。有机氮源包括鱼粉蛋白胨、大豆蛋白胨、鱼粉、豆饼粉、谷糠等。其中以鱼粉蛋白胨为最佳,它对产物的生成有明显的促进作用,一般使用量为0.4%~0.6%。在氮源浓度较低时,随氮源浓度的提高,细胞浓度也增加,黄原胶的合成速率加快,黄原胶得率也相应提高。起始氮源在中等浓度时,细胞浓度和黄原胶的合成速率均有提高,发酵时间被缩短,但黄原胶的得率却降低,这是因为细胞生长过快,使用于细胞生长及维持细胞生命的糖量增加,用于合成黄原胶的糖反而减少,导致黄原胶得率下降。如果采用发酵后期流加糖的方法,使糖浓度始终维持在一定的水平,那么,由于补加的糖只用于细胞维持生命及合成黄原胶,而没有生长的消耗,从而得率就可比间歇发酵有较大提高。若起始氮源的浓度再提高,虽然细胞浓度有所增加,但黄原胶得率及合成速率却降低了。其主要原因是氧限制,高浓度细胞随着发酵的进行,发酵液粘度不断增大,体积传质系数降低,造成氧供应能力逐渐下降,合成速率变慢,得率降低。

  黄原胶发酵培养基的起始pH值一般控制在6.5~7.0,这有利于初期的细胞生长和后期的黄原胶合成。

  黄原胶通常由玉米淀粉辅以氮源及微量元素经微生物发酵后制得。发酵醪中除含黄原胶(3%左右)外,还有菌丝体、未消耗完的碳水化合物、无机盐及大量的液体。其中菌丝体等固形物占20%,水溶性无机盐占10%。如果菌丝体等固形物混杂在黄原胶成品中,会造成产品的色泽差、味臭,从而限制了黄原胶的使用范围。因此黄原胶的分离提取,其目的在于按产品质量规格的要求将发酵醪中的杂质不同程度地除去,通过纯化、分离、浓缩和干燥等手段获得成品。黄原胶成品分食品级、工业级和工业粗制品3种。 ① 溶剂沉淀法

  先将发酵液用6mol/LHCI酸化,然后加入工业酒精使黄原胶沉淀。过滤后沉淀物先后用工业酒精和10%KOH洗涤,过滤,沉淀物干燥后进行粉碎,经过筛制得成品。本法由于直接用HCl和工业酒精进行酸化沉淀,没有去除掉菌体,因此仅能制得工业级黄原胶。

  为了制得食品级黄原胶,在上面的方法基础上增加了离心除菌体和多次用酒精进行沉淀、洗涤的操作,从而提高了成品的纯度。

  溶剂沉淀法工艺简单,产品质量高,大型化生产技术成熟,是目前国内采用的主要生产方法,但该方法溶剂用量大,需设置溶剂回收设备,投资较大,生产成本高。本法提取收率在97.7%。

  在酸性条件下,黄原胶与氯化钙形成黄原胶钙凝胶状沉淀;加入酸性酒精脱去钙离子,使成短絮状沉淀;过滤,在沉淀中加人酒精并用氢氧化钾溶液调节pH值。

  絮凝剂与黄原胶作用产生絮状沉淀,然后将沉淀物脱水,得到固型物含量为25%左右的湿滤饼;用多糖的非溶剂在适当条件下洗提上述湿滤饼,使其变为水溶性多糖。然后过滤,将水溶性滤饼干燥;经粉碎、筛分后得到合格的黄原胶成品。

  本法采用滚筒干燥或喷雾干燥等方法,直接将发酵液进行干燥,从而制成工业粗制品级的黄原胶。该方法因为没有分离提纯工序,所以成品质量差,限于对黄原胶质量要求不高的场合使用,有利于降低产品成本。

  本法采用近代分离技术,对高分子的黄原胶与小分子的无机盐和水进行超滤分离,将黄原胶发酵液浓缩至2.5%~5%,而无机盐浓度从10%降低至0.5%~1%,然后再进行喷雾干燥。本法与直接干燥法相比,产品质量有所提高,达到工业精制品等级。

  本法用酶处理发酵液,将蛋白质水解,从而使发酵液变得澄清,简化了离心过滤这一步工序。本法使用的酶包括碱性蛋白酶,酸性或中性蛋白酶,或用复合酶共同进行作用。用酶处理后,不但发酵液澄清度提高,而且氮含量降低,过滤性能得到改善,在微孔过滤中过滤速度可提高3~20倍,成品质量也有提高。 综上所述,黄原胶的分离提取方法很多,但在应用上都受到各自条件、特点的制约。比较而言,采用超滤浓缩纯化发酵液的方法是比较理想的选择。

  为了便于保藏和运输,一般都将黄原胶制成干品。黄原胶的干燥有不同的处理方法:真空干燥、滚筒干燥、喷雾干燥、流化床干燥以及气流干燥。由于黄原胶是热敏性物质,不能承受长时间的高温处理,因此使用喷雾干燥法会使黄原胶的溶解性变差。滚筒干燥虽然热效率较高,但机械结构较复杂,用于大型工业化生产目前还难实现。带有惰性球的流化床干燥,因兼有强化传热传质以及研磨粉碎的功能,物料滞留时间也较短,所以适合像黄原胶那样的热敏性粘稠物料进行干燥。

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